Menu Close

Elke knutselaar kan genetisch manipuleren met een bacterie

Genetisch manipuleren met bacteriën is niet voorbehouden aan grote biologische laboratoria. Met enkele honderden guldens, wat vindingrijkheid en veel oefening kan elke hobbyist in de keuken aan de slag. Bacteriën, genen en grondstoffen zijn bij bedrijven of onderzoekers verkrijgbaar. En het hoeft niet bij onschuldige proefjes te blijven.

HET MAG misschien niet, maar het kan heel gemakkelijk: zelf bacteriën genetisch manipuleren. Al wekken de termen ‘biotechnologie’ en ‘DNA-recombinatie’ associaties met grote laboratoria vol zuurkasten, dure apparaten en uitgebreide veiligheidsmaatregelen, een kenmerk van genetische manipulatie is juist dat de experimenten op de keper beschouwd betrekkelijk eenvoudig zijn uit te voeren.

Een voorbeeld van een genetisch experiment dat in principe in elke keuken zou kunnen worden uitgevoerd, wordt onder op deze pagina beschreven. Bacteriën uit het darmkanaal, Escherichia coli geheten, kunnen gemakkelijk worden opgekweekt – dat is ook één van de redenen voor zijn grote populariteit onder microbiologen. Vervolgens kunnen enkele nieuwe erfelijke eigenschappen, waaronder resistentie tegen een bepaald antibioticum, worden ingebouwd met behulp van ‘plasmiden’: cirkelvormige stukjes DNA waarop eerst door anderen genen zijn aangebracht. Plasmiden komen in veel bacteriën voor, en kunnen los van het grotere bacterie-chromosoom bestaan of erin worden opgenomen.

Voorhoede

Aan de benodigheden voor zo’n experiment is betrekkelijk gemakkelijk te komen. Prijzige laboratorium-apparatuur kan vervangen worden door geïmproviseerde keukenhulpmiddelen. Chemicaliën kunnen worden besteld bij apotheker of drogist en het glaswerk is verkrijgbaar bij handelaren in laboratorium-artikelen. Het bij de proef gebruikte plasmide, met daarop twee genen, is net als vele andere vrij te koop bij grote chemische bedrijven. Voor nog geen driehonderd gulden is het huislaboratorium compleet.

Wie twintig jaar geleden hetzelfde experiment zou hebben uitgevoerd, had zich daarmee in de voorhoede van het biotechnologisch onderzoek begeven. Vandaag de dag zijn zulke proeven eigenlijk alweer een beetje ouderwets – ze behoren tot het standaardrepertoire van het genetisch laboratorium, en worden ze gebruikt om te controleren of andere, meer vergaande pogingen om genen over te brengen, zijn geslaagd.

Wat de oude en de nieuwe experimenten met elkaar gemeen hebben, is dat de achterliggende theorie betrekkelijk eenvoudig is. De problemen liggen veeleer in het praktische vlak: decennia van genetisch onderzoek hebben vooral steeds meer en steeds ingewikkelder recepten opgeleverd die stipt moeten worden nageleefd om zo vaak mogelijk het gewenste resultaat op te leveren.

Sommige van die recepten kunnen met enig improvisatietalent met huis-, tuin- en keukenapparatuur worden uitgevoerd, al zal de kans op succes natuurlijk wel wat afnemen. Maar wanneer een aantal van de ingewikkelde chemische oplossingen in de toekomst kant en klaar in een bouwdoos zouden worden opgenomen, zal de uitvoering weer een stuk worden vereenvoudigd.

Inderdaad verscheen kortgeleden op de Amerikaanse markt het eerste commerciële biotechnologische bouwpakket. Voor nog geen 1200 gulden voorziet de maker, Larry Slot uit Massachusetts, de fanatieke hobbyist van een pakket waarmee de eerste schreden op het pad van de genetische manipulatie kunnen worden gezet.

Het pakket bevat alle ingrediënten voor een experiment waarmee genen kunnen worden overgedragen van de ene stam mond-bacteriën in de andere. De ene stam, die net als de andere uit wat schraapsel van de binnenwand van de wang gekweekt kan worden, is doorzichtig en zorgt voor onwelriekende adem. De andere is zwart, dankzij een enzym dat tandglazuur afbreekt. In het experiment wordt een gen uit de zwarte bacteriestam los geweekt en ingebouwd in de doorzichtige stam.

Het bouwpakket heeft in Duitsland al tot onrust geleid. Televisiekijkers daar zagen knutselende ‘bio-hackers’ die in donkere kelders naar hartelust experimenteerden met complete biochemische laboratoria. Gesuggereerd werd dat het niet bij onschuldige proefjes zal blijven: ook gevaarlijker experimenten zijn niet uitgesloten. Schadelijker bacteriën als Salmonella, verantwoordelijk voor veel voedselvergiftigingen, zouden bij voorbeeld met een biologisch gif plus resistentie tegen vele antibiotica uitgerust kunnen worden. Zo’n ziekteverwekkend micro-organisme zou dan amper meer te bestrijden zijn. Zulke gevaarlijke proeven zijn overigens wel wat ingewikkelder dan het beginnersexperiment op deze pagina. Alleen al de lijst met benodigdheden zou zich flink uitbreiden: zonder waterbadjes met thermostaat en broedstoofjes, maar vooral peperdure ‘restrictie-enzymen’ en ‘elektroforese-apparatuur’ blijven de mogelijkheden uiteindelijk toch beperkt.

Vergunning

Genetisch knutselen in de eigen keuken staat wel op gespannen voet met de wet. Op grond van het ‘Besluit genetisch gemodificeerde organismen’ mogen genetisch veranderde bacteriën niet in het milieu worden gebracht zonder een vergunning van de minister van milieubeheer. Die geeft zo’n vergunning alleen wanneer zijn adviseurs, verenigd in de Voorlopige Commissie Genetische Modificatie (VCOGEM), de mogelijke gevaren hebben onderzocht.

‘Het milieu’ is in de wet een bijzonder ruim omschreven begrip: in feite behoort alles tot het milieu, met uitzondering van afgeschermde laboratoria die over een speciale vergunning beschikken. De keuken van een particulier valt daardoor ook onder ‘het milieu. Voor elk huis-experiment waarbij een ‘genetisch gemodificeerd organisme’ ontstaat, is dus automatisch een vergunning vereist. “En zo’n vergunning krijg je never“, voorspelt VCOGEM-secretaris dr J.E.N. Bergmans met grote stelligheid.

Naar het antwoord op de vraag of in Nederlandse keukens genetisch wordt gesleuteld, kan men alleen maar gissen. “Ik zelf hoor nooit studenten zeggen dat ze experimenten thuis uitvoeren”, zegt Bergmans, “maar het is niet uit te sluiten dat het wel gebeurt. De technieken zijn betrekkelijk eenvoudig, en de methoden zijn langzamerhand goed bekend. Een echte knutselaar krijgt het in zijn keuken wel voor elkaar.”

De kans dat enthousiaste hobbyisten hun pogingen lang volhouden, acht Bergmans overigens niet zo groot. “Na de eerste experimenten zal de lol er snel af zijn, want aan genetisch veranderde bacteriën is niet zo veel te zien. En voor de echt leuke experimenten heb je eigenlijk alweer een compleet laboratorium nodig, met liefst ook betere analytische methodes om te kijken of de proef ook is geslaagd.”

Desondanks zou Bergmans het ‘een maatschappelijk zeer ongewenste situatie’ vinden wanneer via bouwdozen het genetisch thuiswerk in omvang zou toenemen. “Er is een aantal betrekkelijk onschuldige experimenten, die ook vaak op practica door studenten worden gedaan, waartegen weinig bezwaar bestaat. Maar de grens ligt bij het inbrengen van nieuwe genen in bacteriën.”

In theorie levert ook het beschreven experiment geen gevaar op. Een van de ingebouwde genen komt ook van nature veel in E. coli-bacteriën voor. Maar een verdere verspreiding van resistentie tegen antibiotica als gevolg van thuisexperimenten zou toch wel ongewenst zijn, vindt Bergmans. In ziekenhuizen wordt het immers steeds moeilijker bacteriële infecties te bestrijden, omdat een groeiend aantal bacteriestammen resistent wordt tegen een groot aantal antibiotica.

De wetgever die zou willen proberen paal en perk te stellen aan de mogelijkheden thuis genetisch te manipuleren, staat echter voor een niet eenvoudige opgave.

Een speelgoedfabrikant die, naast de vertrouwde scheikundedoos, ook een genetische-manipulatiedoos uitbrengt kan misschien nog wel worden aangepakt, want hij zou meewerken aan een onrechtmatige daad: het zonder vergunning in het milieu brengen van een ‘GGO’, een genetisch gemodificeerd organisme.

Veel moeilijker is het om iets te doen aan het feit dat kant en klare genen vrij op de markt verkrijgbaar zijn. De huidige wet stelt geen enkele beperking aan de verkoop van losse DNA-plasmiden, omdat het nu eenmaal geen ‘organismen’ zijn. Pas wanneer plasmiden zijn ingebouwd in een virus of een bacterie is sprake van een ‘GGO’, en mogen ze niet meer vrij worden verkocht. Dat wil niet zeggen dat het in de praktijk ook niet gebeurt. Er zijn inmiddels al analytische kits op de markt waarin ook veranderde bacteriën zijn opgenomen. Volgens Bergmans is dat probleem inmiddels onderkend. “Er zit wat dat betreft nog een gat in de handhaving van de wet. Er wordt nagedacht over een manier om dat af te dichten.”

Naast de commerciële verkoop van stukjes DNA bestaat echter nog een ander belangrijk circuit, waarin andere regels bestaan: het behoort tot de standaardroutine van moleculair-biologen overal ter wereld om bij collega’s plasmiden op te vragen om experimenten te kunnen controleren, herhalen of uitbreiden. Wie in dit circuit wil inbreken, heeft niet veel meer nodig dan papier met een fraai briefhoofd en een deskundig ogende tekst.

Bovendien sturen onderzoekers elkaar niet alleen DNA-plasmiden, maar ook complete genetisch veranderde bacteriën op. Volgens de regels mag dat alleen wanneer zij eerst controleren of de ontvanger een vergunning voor genetische experimenten heeft. Maar of die controle altijd plaatsvindt, is de vraag, erkent Bergmans.

Hij wijst er wel op dat wetenschappers in het algemeen niet zo happig zijn op het versturen van hun allernieuwste onderzoeksmateriaal. Maar hij geeft toe dat iemand die echt aan een bepaald stuk DNA wil komen, het langs deze weg uiteindelijk wel kan krijgen. Zelfs genen voor uiterst giftige biologische stoffen, toxinen, vormen daarop geen uitzondering. Wel wijst Bergmans erop dat ziekteverwekkende genen vooral worden gebruikt in economisch interessant onderzoek, zoals de ontwikkeling van vaccins. Dan zullen onderzoekers niet staan te springen om genetisch materiaal af te staan, verwacht hij, uit angst dat profijtelijke octrooien aan hun neus voorbijgaan. “En als het om echt gevaarlijk materiaal gaat, kan ik me niet voorstellen dat onderzoekers het zomaar opsturen.”

‘Als het goed is, zijn er blauwe, maar ook witte kolonies zichtbaar’

Voor het experiment hebben we nodig van een magazijn voor laboratoriumbenodigdheden:
– 2 schroefpotjes van 1 liter en 5 van 100 milliliter (al voldoen augurkenpotjes ook);
– 1 maatcilinder van 100 ml (f 10);
– 1 maatcilinder van 10 ml (f 8);
– 10 petrischaaltjes (f 25);
– 5 reageerbuisjes (f 2,50), en
– 10 injectiespuiten van 5 ml (f 3).
Van groothandel of apotheek:
– 42 g Na2HP04.2H20 (f 13);
– 15 g KH2PO4 (f 12);
– 5 g NaCl (gewoon keukenzout);
– 5 g NH4Cl(f ll);
– 20 g MgSO4(f 11);
– 5 g CaCl2 (f 11);
– 10 g tris (f 3);
– 5 g MgCl2(f 11), en
– 20 g glucose (f 3)
Van Sigma Chemie (Grünwalderweg 30, 8024 Deisenhofen, Duitsland, tel. 09-49-89-613010):
– 20 mg ampicilline (f 12);
– 250 g agar-poeder (ƒ 90);
– 100 mg X-Gal (f 125), en
– 0,01 mg pUC8 plasmide (f 80).
Verder 20 cm dun ijzerdraad, een keukenweegschaal, een snelkookpan, een thermometer, een pak steriele watten en een (staande) wascentrifuge.

DOEL VAN DIT experiment is een stam bacteriën uit onze eigen darmen, Escherichia coli, op te kweken en te voorzien van twee nieuwe eigenschappen: resistentie tegen ampicilline, en de mogelijkheid een bepaalde voedingsstof af te breken zodat er een blauwe kleurstof ontstaat.

Voor de eerste eigenschap is het gen Ampr nodig, voor de tweede een gen dat codeert voor het enzym bèta-galactosidase (lac). Beide genen zitten op een los stukje cirkelvormig DNA, een plasmide. Het plasmide met daarop de genen Ampr en lac is vrij in de handel verkrijgbaar; wij moeten de bacteriën zo gek krijgen het plasmide van buitenaf op te nemen.

Reinig de keuken vooraf zo goed mogelijk. Steriliseer al het te gebruiken water en al het glaswerk door het 20 minuten te komen in de snelkookpan (liefst op 120°C). Laat potjes en petrischalen steeds zo kort mogelijk openstaan: sluit alles steeds goed af met een gesteriliseerde schroefdop (reageerbuisjes met een propje steriele watten) en bewaar alles in de koelkast (daar groeien bacteriën langzaam). Haal voor je een potje opent of sluit de opening en de dop heel even door een gasvlam. Houd geopende potjes zoveel mogelijk in de hete lucht boven zo’n vlam.

Dag 1.

Om tijdens het eigenlijke experiment de handen vrij te hebben, besteden we de eerste dag aan het brouwen van zoveel mogelijk van de benodigde chemische mengsels. Zorg voor enkele liters gesteriliseerd water.
Mengsel A: los 42 g Na2HPO4.2H20, 15 g KH2PO4, 2,5 g NaCl en 5 g NH4Cl op in een literfles met 500 ml water.
Mengsel B: los 12 g MgS04 op in een flesje met 100 ml water.
Mengsel C: los 1 g CaCl2 op in een flesje met 100 ml water.
Mengsel D: los 20 g glucose op in een flesje met 80 ml water.
Voeg aan 300 ml water 200 ml van mengsel A, 2 ml van mengsel B, 1 ml van mengsel C en 20 ml van mengsel D toe. Het resultaat noemen we oplossing E. In een flesje waarin al 50 ml water zit, voegen we 50 ml van deze oplossing E toe. Dit is het Groeimedium. Bewaar het in de koelkast.
Mengsel F: los 13 g agar op in literfles met 500 ml steriel, heet water (60°C of meer).
Mengsel G: los 100 mg X-Gal op in reageerbuis met 5 ml water.

Voeg het nog hete mengsel F bij het restant van oplossing E. Voeg tevens 2 ml van mengsel G toe. Giet de vloeistof direct, voor het is gestold, over in de bodem van de petrischalen (ca. 30 ml per schaal). Haal steeds het deksel hooguit enkele seconden van de schaaltjes, en bewaar ze dicht in de koelkast.

Dag 2.

Wacht een stoelgang af, en bewaar een heel klein beetje van de vaste uitwerpselen in een potje. Draai met een tangetje een uiteinde van het ijzerdraad tot een klein ringetje met een doorsnee van een paar millimeter. Houd het ringetje in een gasvlam tot het gloeit, en houd een afgesloten petrischaal met gestold groeimedium bij de hand. Steek het oogje in de faeces en strijk die enkele malen, met de klok mee, uit over het medium in een hoek van de schaal (zie tekening 1, bij A). Haal het oogje weer door de vlam en strijk het laatste stukje van de eerste streken enkele malen verder met de klok mee uit (1, B). Verricht deze handeling nog twee keer (C, D), tot je bijna rond bent. De bacteriën worden zo steeds verder ‘verdund. Op deze manier groeit de kans dat we straks een bacteriekolonie zien die uit één bacterie is voortgekomen.

Sluit het petrischaaltje goed af, en bewaar het twee nachten bij ongeveer 37°C (lichaamstemperatuur), bij voorbeeld onder de dekens. Houd het ook overdag lekker warm, dan groeien de bacteriën het best.

Dag 4.

Als het goed is, zijn ‘s morgens op het medium blauwgekleurde, maar ook witte kolonies E. colibacteriën zichtbaar. Pik met het afgevlamdé ijzer-oogje een enkele witte kolonie op, en strijk die uit over een nieuwe agar-schaal. Verdun’ de bacteriën weer zoals in tekening 1 en neem de schaal twee nachten mee naar bed.

Dag 6.

Herhaal de procedure van dag 4 met een enkele witte kolonie, en neem hem weer twee nachten bij je in bed.

Dag 8.

Wanneer de ochtend van de achtste dag is aangebroken, beschikken we, wederom als het goed is, over enkele duidelijk afgescheiden, ronde kolonies witte E. colibacteriën. Zij zijn niet in staat het X-Gal in het groeimedium af te breken doordat ze het gen voor bèta-galactosidase missen.

Nu zullen we dit gen, samen met het gen voor resistentie tegen het antibioticum ampicilline, bij deze bacteriën gaan inbrengen. Eerst nog een mengsel maken, mengsel H: los 1 g CaCl2 op in 100 ml water. Bewaar in koelkast.

Neem uit de koelkast de bewaarde 100 ml ‘Groeimedium’. Breng hierin met het afgevlamde ijzer-oogje één bacteriekolonie en sluit het potje direct af met een prop steriele watten. Bewaar het potje zeven uur bij een temperatuur van 37 °C, regelmatig (liefst voortdurend) licht schuddend – de bacteriën hebben zuurstof nodig om te kunnen groeien. Laat ze doorgroeien tot de vloeistof troebel is van de ronddrijvende bacteriën.

Zet het flesje tien minuten in een bakje ijs in de koelkast. Sluit het af met een (steriele) waterdicht afsluitende dop, en bind het met een elastiekje stevig vast op het plastic afdekroostertje van de wascentrifuge, platliggend met de bodem naar de buitenkant gekeerd. Bind een ander flesje, met ongeveer even veel water, precies aan de overkant op dezelfde wijze vast (tekening 2). Leg het rekje op de bodem van de centrifuge, en dek het eventueel met een flinke handdoek af. Laat de centrifuge ongeveer een half uur draaien.

Na afloop klitten de meeste bacteriën samen op de bodem van het flesje. Giet het groeimedium voorzichtig af, zodat de bacteriën achterblijven.

Voeg 50 ml van mengsel H bij de bacteriën, en zet het flesje een paar uur in de koelkast. Centrifugeer de oplossing weer, en giet de vloeistof af. Breng 4 ml van mengsel H in een steriele reageerbuis, en breng zoveel mogelijk van de bacterie-vlok in de buis over. Sluit af met watten, en bewaar het 12 tot 24 uur in de koelkast. De bacteriën zijn nu voorbereid om stukjes DNA uit de buitenwereld op te nemen.

Dag 9.

Maak eerst mengsel J: los de 20 mg ampicilline op in een reageerbuis met 5 ml water, en mengsel K: los 6 g tris en 1 g MgCl2 op in 100 ml water.

Breng 1 ml van oplossing E over in een reageerbuis en voeg daarbij één druppel van mengsel J. Dit is het Groeimedium met ampicilline. Neem 2,5 ml van oplossing E. en spuit die in het buisje met pUCplasmide. Schud licht, en gooi het mengsel bij 22 ml van mengsel K. Bewaar het een half uur in een ijsbadje in de koelkast.

Voeg voorzichtig 0,1 ml – een druppeltje – bij de reageerbuis met de bacteriën. Zet de reageerbuis onmiddellijk daarna in een waterbadje met een temperatuur van 42°C. Wacht 2 minuten, en zet het buisje een half uur in een badje van 37°C. Voeg dan 1 ml ‘Groeimedium met ampicilline’ toe, zodat alleen bacteriën die daartegen bestand zijn overblijven.

Steek het afgevlamde ijzer-oogje enkele malen in de oplossing, en strijk het in strepen uit over de gehele oppervlakte van een agarschaaltje. Giet het restant uit over een of meer andere agar-schaaltjes. Laat de platen even liggen tot de vloeistof is geabsorbeerd. Sluit ze goed af, en bewaar ze bij ongeveer 37 °C.

Dag 10.

Nu horen blauwe bacteriekolonies zichtbaar te worden. Wanneer dat inderdaad het geval is, is je eerste experiment met genetische manipulatie geslaagd: je hebt twee nieuwe erfelijke eigenschappen aan een stam E. coli-bacteriën toegevoegd.

Steriliseer de schaaltjes en de rest van het glaswerk in de snelkookpan, om te voorkomen dat de resistente bacteriën zich in het milieu verspreiden.

Related Posts